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  [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en

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homer7723



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MessageSujet: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Jeu 23 Juil 2015 - 10:49

Bonjour à tous,

Je fais appel à vous pour optimiser ma technique en qPCR. J'ai un peu de mal à obtenir des duplicates avec moins de 0,5 Ct d'écart (quelques un sur ma plaque, pas tous les duplicates non plus).
Je vais vous présenter ma méthodologie et matériel et n'hésitez pas à me faire vos remarques pour m'aider à m'améliorer !

Pour déposer mon mix (SYBR Green) j'utilise une pipette de 20 µl. Je dépose 8 µl par puits (plaque 96). Je prémouille d'abord mon cône puis je dépose avec le même cône tout mon mix.
Pour cette étape, que puis je améliorer? Changer plus souvent de cône? Utiliser une multipette?

Ensuite, pour déposer mes cDNA (2µl par puits), j'utilise une pipette de 10µl. Je change de cône à chaque puits. Cette fois, pas de prémouillage, j'aspire le volume et dépose dans mon puits. Je dépose ma goutte directement sur la paroi. Je centrifuge ensuite ma plaque avant de lancer mon run.

Je vous remercie pour toutes les critiques que vous pourrez m'apporter pour m'aider à m'améliorer !
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Steph



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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Jeu 23 Juil 2015 - 13:37

Salut homer et bienvenue sur le forum!

Ce forum est plutôt un forum généraliste, mais il se fait que je suis biologiste cellulaire avec un peu d'expérience en bio mol.
Je vais faire mon possible pour t'aider mais je ne suis pas spécialiste en qPCR.

Concernant ta technique de pipettage:
Tu peux la tester simplement en pesant de l'eau sur une balance de précision. Tu obtiendras ainsi un écart type précis pour un type de pipette et des tips donnés. Du même coup cela te permet de vérifier si la micropipette répond aux normes (les limites sont inhérentes à chaque pipette).

La qualité des tips est aussi importante que la technique, il faut pas le sous-estimer.
Perso j'utilise les diamonds de Gilson, les eppendorf ont aussi une bonne réputation.
Je prémouille aussi toujours les tips, c'est d'autant plus important pour les petits volumes car sinon tu dépose moins que tu n'aspires.
Tu n'as pas besoin de prémouiller si tu déposes ton volume dans un liquide car alors tu peux rincer le tip, mais dans un puit sec, c'est important.

Pour 2 µl pourquoi ne pas utiliser une micropipette de 2µl?? Elle sera bien plus précise!

Enfin, une pipette doit être régulièrement entretenue et calibrée. Je sais que dans les universités on s'en fout royalement et des micropipettes sont utilisées intensivement pendant des années sans entretien mais c'est un des instruments les plus importants, il faut en prendre soin.


Sinon il faudrait vérifier les autres sources d'erreur: est-ce que les autres utilisateurs de l'appareil ont le même problème (chauffage inhomogène de la plaque)?
Est-ce que d'autres personnes utilisant les mêmes solutions ont le même problème?
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homer7723



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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Jeu 23 Juil 2015 - 14:59

Merci beaucoup pour ton retour Steph.

Ne possédant pas de balance de précision, je ne peux pas vérifier la précision de mes micropipettes.

Concernant les tips, j'utilise des Neptune avec des filtres. Ils ont bonne réputation et c'est le type de tips que j'ai croisé en général dans les différents labo.
Pour le prémouillage, je l'effectue pour déposer mon mix (dépôt de 8µl). Mais il est vrai que je ne le fais pas pour déposer mes cDNA (2µl), je prélève directement puis je dépose.

Pour la micropipette de 2µl, nous n'avons tout simplement pas mais je suis entièrement d'accord que ce serait beaucoup plus précis !

Et pour l'entretien des pipettes, je travaille dans un labo INSERM, donc disons que l'entretien est,... occasionnel !

C'est un problèmes qui arrive à plusieurs utilisateurs. L'appareil est neuf et je souligne qu'il s'agit de variations sur un nombre assez faible de duplicates.
Selon moi le problème vient effectivement du pipetage des 2µl avec une pipette mal adaptée (pipette de 2-10µl). Mais je voulais exposer ma méthodologie pour avoir le plus de remarques possibles afin de m'améliorer !

Merci encore
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Steph



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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Ven 24 Juil 2015 - 9:21

Tu dis seulement quelques puits, toujours les mêmes sur la plaque (aux mêmes positions)?

Maintenant il faut voir si une erreur de 0,5Ct est tellement grave.
En reprenant les résultats d'une qPCR faite par une firme privée pour mon compte, je trouve les triplicats suivants:

25,24 25,21 25,45
28,39 29,1        28,76
24,5        24,38 24,56
24,89 24,27 24,28
24,17 24        24,44
22,37 22,17 22,76
23,32 23,36 23,95
22,69 22,54 22,21
22,63 22,68 22,22
22,34 22,12 22,49
23,05 23,04 22,57
24,33 24,22 24,32
23,62 24,61 24,35
23,72 24,29 22,94
23,71 24,28 24,01

On voit quelques écarts >0,5 Ct.
Maintenant 0,5 sur 25 ca fait du 2% d'écart type, c'est pas mal du tout!
En ELISA par exemple je suis souvent autour de 5%, jusqu'à 10% je considère la qualité acceptable.
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homer7723



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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Ven 24 Juil 2015 - 13:27

Bonjour Steph.

Non les erreurs sont un peu aléatoire, ce qui me pousse à croire qu'il s'agit de mon pipetage.

Je suis assez étonné des écarts de cycle que tu présentes. Mais il s'agit de triplicate donc l'écart par rapport à la moyenne est moins important que lorqu'on réalise seulement des duplicate.
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Steph



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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Ven 24 Juil 2015 - 14:00

Si j'étais dans ton cas je chercherais une balance de précision (il doit bien y avoir une dans un labo, les labos sont rarement isolés au milieu des bois) et je calculerais l'écart type en pipettant 2µl avec une micropipette de 10µl EN PREMOUILLANT le tip.
Déjà rien qu'en prémouillant le tip, peut-être que ca résoudra définitivement ton problème. Je sais c'est embêtant et ca fatigue les doigts, mais quand on veut de la qualité y a pas de compromis faut transpirer Very Happy
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homer7723



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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Ven 24 Juil 2015 - 14:41

Merci pour ton aide Steph.
Et pour ce qui est de transpirer, à 30°C dans les labos plus la blouse, on est servi sunny sunny sunny
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narduccio



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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Ven 24 Juil 2015 - 15:16

Oui, dans ces conditions, la sueur c'est pas en µl qu'on la produit. Wink

_________________
Une théorie n'est scientifique que si elle est réfutable
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Steph



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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    Mar 28 Juil 2015 - 15:51

Effectivement et avec des gants en latex c'est particulièrement agréable.
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MessageSujet: Re: [Biologie Moléculaire] Aide pour optimiser ma technique en    

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